金黃色葡萄球菌檢測要點(diǎn)

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于微球菌科葡萄球菌屬，典型的金黃色葡萄球菌為球形，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金黃色葡萄球菌無芽孢和鞭毛，大多數(shù)無莢膜，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶陽性細(xì)菌，能夠產(chǎn)生很強(qiáng)的凝固酶陽性反應(yīng)。該菌對營養(yǎng)要求不高，在普通培養(yǎng)基上生長良好，需氧或兼性厭氧，最適生長溫度37℃，最適pH 為7.4，生長pH范圍為4.2-9.8。該菌可耐受極低的水分活度（0.86），并可在含鹽或含糖濃度較高的食品中繁殖，在干燥環(huán)境下可存活數(shù)月，對熱有較強(qiáng)抵抗力。

金黃色葡萄球菌主要污染營養(yǎng)豐高且含較多水分的食品，如乳類及乳制品、肉類、剩飯等，其次為熟肉類，偶見魚類及其制品、蛋制品等。部分金黃色葡萄球菌能夠引發(fā)包括由于腸道毒素的消化吸收引發(fā)的胃腸炎等各種疾病綜合癥。

一系列產(chǎn)品稀釋液被接種到選擇性鑒別瓊脂培養(yǎng)基中，產(chǎn)生典型的金黃色葡萄球菌菌落，金黃色葡萄球菌菌落通過凝固酶反應(yīng)確定。每克樣品的金黃色葡萄球菌數(shù)量以凝固酶陽性菌落的比例為基礎(chǔ)而計(jì)算得到。

初步鑒定

金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2mm-3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感。有時(shí)可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。在血平板上,形成菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時(shí)為白色),菌落周圍可見*透明溶血圈。挑取上述可疑菌落進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn)。

確證鑒定

1.染色鏡檢:金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,排列呈葡萄球狀,無芽胞,無莢膜,直徑約0.5μm-1μm。

2 血漿凝固酶試驗(yàn):挑取Baird-Parker平板或血平板上至少5個(gè)可疑菌落(小于5個(gè)全選),分別接種到5mLBHI和營養(yǎng)瓊脂小斜面,36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h。

取新鮮配制兔血漿0.5mL,放入小試管中,再加入 BHI培養(yǎng)物0.2mL-0.3mL,振蕩搖勻,置36℃±1℃溫箱或水浴箱內(nèi),每半小時(shí)觀察一次,觀察6h,如呈現(xiàn)凝固(即將試管傾斜或倒置時(shí),呈現(xiàn)凝塊)或凝固體積大于原體積的一半,被判定為陽性結(jié)果。同時(shí)以血漿凝固酶試驗(yàn)陽性和陰性葡萄球菌菌株的肉湯培養(yǎng)物作為對照。也可用商品化的試劑,按說明書操作,進(jìn)行血漿凝固酶試驗(yàn)。

結(jié)果如可疑,挑取營養(yǎng)瓊脂小斜面的菌落到5mLBHI,36 ℃±1 ℃培養(yǎng)18h~48h,重復(fù)試驗(yàn)。

結(jié)果與報(bào)告

1.結(jié)果判定:符合初步鑒定、確證鑒定的可判定為金黃色葡萄球菌。

2.結(jié)果報(bào)告:在25g(mL)樣品中檢出或未檢出金黃色葡萄球菌。

典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)

1.金黃色葡萄球菌在 Baird-Parker平板上呈圓形,表面光滑、凸起、濕潤、菌落直徑為2 mm-3mm,顏色呈灰黑色至黑色,有光澤,常有淺色(非白色)的邊緣,周圍繞以不透明圈(沉淀),其外常有一清晰帶。當(dāng)用接種針觸及菌落時(shí)具有黃油樣黏稠感。有時(shí)可見到不分解脂肪的菌株,除沒有不透明圈和清晰帶外,其他外觀基本相同。從長期貯存的冷凍或脫水食品中分離的菌落,其黑色常較典型菌落淺些,且外觀可能較粗糙,質(zhì)地較干燥。

2.選擇有典型的金黃色葡萄球菌菌落的平板,且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20CFU-200CFU 之間的平板,計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。

3.從典型菌落中至少選5個(gè)可疑菌落(小于5個(gè)全選)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)。分別做染色鏡檢,血漿凝固酶試驗(yàn);同時(shí)劃線接種到血平板36℃±1℃培養(yǎng)18h-24h后觀察菌落形態(tài),金黃色葡萄球菌菌落較大,圓形、光滑凸起、濕潤、金黃色(有時(shí)為白色),菌落周圍可見*透明溶血圈。

結(jié)果計(jì)算

1.若只有一個(gè)稀釋度平板的典型菌落數(shù)在20CFU-200CFU 之間,計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計(jì)算。

2.若稀釋度平板的典型菌落數(shù)小于20CFU,計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計(jì)算。

3.若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU,但下一稀釋度平板上沒有典型菌落,計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計(jì)算。

4.若某一稀釋度平板的典型菌落數(shù)大于200CFU,而下一稀釋度平板上雖有典型菌落但不在20CFU-200CFU范圍內(nèi),應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落,按式(1)計(jì)算。

5.若2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板典型菌落數(shù)均在20CFU-200CFU 之間,按式(2)計(jì)算。

6.計(jì)算公式 式(1):

式中:

T ———樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);

A ———某一稀釋度典型菌落的總數(shù);

B ———某一稀釋度鑒定為陽性的菌落數(shù);

C ———某一稀釋度用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);

d ———稀釋因子。

式(2):

式中:

T ———樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù);

A1 ———稀釋度(低稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);

B1 ———稀釋度(低稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù);

C1 ———稀釋度(低稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);

A2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))典型菌落的總數(shù);

B2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))鑒定為陽性的菌落數(shù);

C2 ———第二稀釋度(高稀釋倍數(shù))用于鑒定試驗(yàn)的菌落數(shù);

1.1———計(jì)算系數(shù);

d ———稀釋因子(稀釋度)。

報(bào)告

根據(jù)公式計(jì)算結(jié)果,報(bào)告每g(mL)樣品中金黃色葡萄球菌數(shù),以 CFU/g(mL)表示;

如T 值為 0,則以小于1乘以稀釋倍數(shù)報(bào)告。